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Gentechnologie für Einsteiger hat sich weltweit als leicht verständliche Einführung in dieses wichtige und spannende Wissenschaftsgebiet bewährt. Die sechste Auflage bleibt dem Grundkonzept früherer Auflagen treu, widmet sich aber auch neuen, wachsenden Forschungsfeldern. Das Buch bleibt damit ein unentbehrlicher Leitfaden für Studierende in den Biowissenschaften und ihren zahlreichen Teilgebieten. Es eignet sich auch bestens als Einführung für alle, die sich in ihrem Beruf mit den Grundlagen des Themas vertraut machen müssen. Terry A. Brown ist Professor an der Fakultät für Biowissenschaften der Universität Manchester.

 

 

/ AUS DEM INHALT: / / / I Grundprinzipien der Klonierung und DNA-Analyse i 1 Warum sind Klonierung und DNA-Analyse so wichtig? 3 1.1 Frühe Entwicklungen in der Genetik 4 1.2 Die Entwicklung der DNA-Klonierung und die Polymerasekettenreaktion 4 1.3 Was ist DNA-Klonierung? 5 1.4 Was ist PCR? 5 1.5 Warum sind DNA-Klonierung und PCR so wichtig? 6 1.5.1 Isolierung eines Gens in Reinform durch Klonierung 7 1.52 Auch mit PCR kann man Gene reinigen 8 1.6 Ein Wegweiser durch dieses Buch 9 Weiterführende Literatur 10 2 Klonierungsvektoren: Plasmide und Bakteriophagen 11 2.1 Plasmide 12 2.1.1 Größe und Kopienzahl 13 2.12 Konjugation und Kompatibilität 14 2.1.3 Klassifikation von Plasmiden 14 2.1.4 Plasmide in anderen Organismen als Bakterien 15 2.2 Bakteriophagen 15 2.2.1 Der Phagen-Infektionszyklus 15 2.2.2 Lysogene Phagen 15 2.2.3 Viren als Klonierungsvektoren für andere Organismen 21 Weiterführende Literatur 21 3 Die Reinigung von DNA aus lebenden Zellen 23 3.1 Die Präparation der gesamten Zeil-DNA 24 3.1.1 Zucht und Ernte einer Bakterienkultur 24 3.12 Die Präparation von Zellextrakten 26 3.13 Die Reinigung der DNA aus dem Zellextrakt 27 3.1.4 Das Anreichern der DNA-Proben 28 3.1.5 Die Messung der DNA-Konzentration 29 3.1.6 Andere Methoden zur Präparation der gesamten Zeil-DNA 29 3.2 Die Präparation von Plasmid-DNA 30 3.2.1 Trennung aufgrund der Größe 31 3.2.2 Trennung aufgrund der Konformation 32 3.2.3 Plasmidamplifikation 34 3.3 Die Präparation von Bakteriophagen-DNA 35 3.3.1 Die Zucht von Kulturen mit hohem A-Titer 36 3.3.2 Präparation nichtlysogener ^-Phagen 37 3.3.3 Die Ernte der Phagen aus einer Infizierten Kultur 37 3.3.4 Die Reinigung von DNA aus Ä-Phagenpartikeln 38 3.3.5 M13-DNA lässt sich leicht reinigen 38 Weiterführende Literatur 39 4 Die Manipulation der gereinigten DNA 41 4.1 Das Spektrum der Enzyme zur DNA-Manipulation 42 4.1.1 Nucleasen 43 4.12 Ligasen 44 4.1.3 Polymerasen 44 4.1.4 DNA-Modifikationsenzyme 45 4.2 Enzyme zum Schneiden der DNA:Restriktionsendonucleasen 46 42.1 Entdeckung und Wirkungsweise der Restriktionsendonucleasen 47 4.22 Die Restriktionsendonucleasen des Typs II schneiden die DNA an ganz bestimmten Nucleotidsequenzen 48 4.2.3 Glatte Enden und klebrige Enden 49 4.2.4 Die Zahl der Restriktionserkennungsstellen in einem DNA-Molekül 49 42.5 Der Ablauf einer Restriktionsspaltung im Labor 50 4.2.6 Die Analyse des Ergebnisses einer Restriktionsspaltung 52 4.2.7 Größenabschätzung bei DNA-Molekülen 53 4.2.8 Die Kartierung der Restriktionsschnittstellen auf einem DNA-Molekül 54 4.2.9 Besondere Elektrophoreseverfahren zurTrennung größerer Moleküle 56 4.3 Ligation: Das Verbinden von DNA-Molekülen 57 4.3.1 Die Wirkungsweise der DNA-Ligase 57 4.32 Klebrige Enden erhöhen die Effizienz der Ligation 57 4.3.3 Das Anfügen klebriger Enden an ein Molekül mit glatten Enden 58 4.3.4 Ligation glatter Enden mit einer DNA-Topoisomerase 62 Weiterführende Literatur 63 5 Das Einführen von DNA in lebende Zellen 65 5.1 Transformation: Die Aufnahme von DNA durch Bakterienzellen 67 5.1.1 Nicht alle Bakterienarten nehmen DNA mit der gleichen Effizienz auf 67 5.12 Die Herstellung kompetenter E. co//-Zellen 68 5.1.3 Die Selektion transformierter Zellen 68 5.2 Die Identifizierung von Rekombinanten 69 5.2.1 Selektion von Rekombinanten mit pBR322: Inaktivierung durch Einbau eines Antibiotika-Resistenzgens 70 5.2.2 Die Inaktivierung durch Einbau von DNA betrifft nicht immer Antibiotikaresistenzen 71 5.3 Das Einführen von Phagen-DNA in Bakterienzellen 72 5.3.1 Transfektion 72 5.3.2 In Wfro-Verpackung 72 5.3.3 Die Phageninfektion wird in Form von Plaques auf einem Agarmedium sichtbar 74 5.4 Die Identifizierung rekombinierter Phagen 75 5.4.1 Inaktivierung eines /acZ'-Gens im Phagenvektor durch die eingebaute DNA 75 5.4.2 Inaktivierung des cl-Gens von Á 75 5.4.3 Selektion mit Hilfe des Phänotyps Spi 75 5.4.4 Selektion anhand der Genomgröße von Á 76 5.5 Einschleusen von DNA in eukaryotische Zellen 76 5.5.1 Transformation einzelner Zellen 77 5.52 Transformation ganzer Organismen 78 Weiterführende Literatur 78 6 Klonierungsvektoren für E. coli 79 6.1 Klonierungsvektoren auf der Grundlage von F. co//-Plasmiden 80 6.1.1 Die Nomenklatur von Plasmid-Klonierungsvektoren 80 6.1.2 Die nützlichen Eigenschaften von pBR322 81 6.1.3 Der Stammbaum von pBR322 81 6.1.4 Weiterentwickelte F. co/i-Plasmid-Klonierungsvektoren 82 6.2 Klonierungsvektoren auf der Grundlage des Bakteriophagen M13 85 6.2.1 Die Konstruktion eines Phagen-Klonierungsvektors 85 6.2.2 Hybridvektoren aus Plasmiden und M13 86 6.3 Klonierungsvektoren auf der Grundlage des Bakteriophagen A 87 6.3.1 Aus dem A-Genom kann man Stücke entfernen, ohne die Funktionsfähigkeit zu beeinträchtigen 88 6.3.2 Durch natürliche Selektion kann man A-Phagen isolieren, denen bestimmte Restriktionsstellen fehlen 88 6.3.3 Insertions- und Substitutionsvektoren 89 6.3.4 Klonierungsexperimente mit A-Insertions- oder A-Substitutionsvektoren 90 6.3.5 Sehr große DNA-Fragmente kann man in Cosmiden klonieren 91 6.4 Mit A- und anderen Vektoren mit hoher Kapazität kann man genomische Bibliotheken konstruieren 92 6.5 Vektoren für andere Bakterien 93 Weiterführende Literatur 94 7 Klonierungsvektoren für Eukaryoten 95 7.1 Vektoren für Hefe und andere Pilze 96 7.1.1 Selektierbare Marker für das 2-Mikron-Plasmid 96 7.1.2 Vektoren auf der Grundlage des 2-Mikron-Ringes: Episomale Plasmide der Hefe 97 7.1.3 Ein YEp kann sich in die chromosomale DNA der Hefe integrieren 98 7.1.4 Andere Hefe-Klonierungsvektoren 98 7.1.5 Mit künstlichen Chromosomen kann man riesige DNA-Stücke in Hefe klonieren 99 7.1.6 Vektoren für weitere Hefearten und andere Pilze 101 7.2 Klonierungsvektoren für höhere Pflanzen 102 7.2.1 Agrobacterium tumefaciens: Der kleinste "natürliche Gentechniker" 102 7.2.2 DNA-Klonierung in Pflanzen durch direkte Genübertragung 106 7.2.3 Versuche zum Einsatz von Pflanzenviren als Vektoren 108 73 Klonierungsvektoren fürTiere 109 7.3.1 Klonierungsvektoren für Insekten 109 7.3.2 Klonierung in Säugetieren 110 Weiterführende Literatur 112 8 Die Gewinnung eines Klons von einem bestimmten Gen 115 8.1 Das Problem der Selektion 116 8.1.1 Es gibt zwei grundlegende Wege, den gesuchten Klon ausfindig zu machen 117 8.2 Direkte Selektion 117 8.2.1 Marker rescue erweitert die Anwendungsmöglichkeiten der direkten Selektion 118 8.2.2 Anwendungsbereich und Grenzen des martovesave-Verfahrens 118 8.3 Die Suche nach Klonen in einer Genbibliothek 119 8.3.1 Genbibliotheken 120 8.3.2 Nicht alle Gene werden zur gleichen Zeit exprimiert 120 8.3.3 mRNA lässt sich als komplementäre DNA klonieren 121 8.4 Methoden zur Identifizierung von Klonen 122 8.4.1 Komplementäre Nucleinsäurestränge hybridisieren untereinander 122 8.4.2 Kolonie- und Plaquehybridisierung 122 8.4.3 Beispiele für den praktischen Einsatz der Nucleinsäurehybridisierung 124 8.4.4 Methoden zur Identifizierung eines klonierten Gens durch den Nachweis seines Genprodukts 13° Weiterführende Literatur 131 9 Die Polymerasekettenreaktion (PCR) 133 9.1 Die Polymerasekettenreaktion im Überblick 134 9.2 Die PCR: einige Einzelheiten 136 92.1 Die Konstruktion der Oligonucleotidprimer für die PCR 136 9.2.2 Die richtige Reaktionstemperatur 137 9.3 Nach der PCR: Die Analyse der Produkte 138 9.3.1 Gelelektrophorese der PCR-Produkte 139 9.3.2 Klonierung von PCR-Produkten 140 9.3.3 Probleme mit der Fehlerhäufigkeit der Tag-Polymerase 141 9.4 Mit der Realtime-PCR kann man die Menge des Ausgangsmaterials quantitativ erfassen 142 9.4.1 Der Ablauf eines Experiments mit quantitativer PCR 143 9.4.2 Mit Realtime-PCR kann man auch RNA quantitativ erfassen 144 Weiterführende Literatur 145 II Die Anwendung von Klonierung und DNA-Analyse in der Forschung 147 10 Die Sequenzierung von Genen und Genomen 149 10.1 Methoden zur DNA-Sequenzierung 150 10.1.1 DNA-Sequenzierung nach dem Kettenabbruchverfahren 150 10.12 Pyrosequenzierung 154 10.2 Die Sequenzierung eines Genoms 156 10.2.1 Das Schrotschussverfahren zur Genomsequenzierung 157 10.2.2 Das Klon-Contig-Verfahren 160 10.2.3 Karten als Hilfsmittel zum Sequenzaufbau 162 Weiterführende Literatur 165 11 Die Untersuchung der Genexpression und Genfunktion 167 11.1 Die Analyse der Transkripte von Genen 168 11.1.1 Nachweis eines Transkripts und Aufklärung seiner Nucleotidsequenz 169 11.1.2 Transkriptkartierung durch Hybridisierung zwischen Gen und RNA 170 11.1.3 Transkriptanalyse durch Primerverlängerung 171 11.1.4 Transkriptanalyse mit PCR 171 11.2 Die Untersuchung der Expressionsregulation von Genen 172 11.2.1 Der Nachweis von Proteinbindungsstellen an einem DNA-Molekül 174 11.2.2 Der Nachweis von Regulatorsequenzen durch Deletionsanalyse 177 11.3 Nachweis und Untersuchung des Translationsprodukts eines klonierten Gens 179 11.3.1 Mit HRTund HART kann man das Translationsprodukt eines klonierten Gens nachweisen 179 11.3.2 Analyse der Proteine durch in Wfro-Mutagenese 181 Weiterführende Literatur 185 12 Genomanalyse 187 12.1 Annotation von Genomen 188 12.1.1 Identifizierung von Genen in einer Genomsequenz 188 12.1.2 Aufklärung der Funktion eines unbekannten Gens 192 12.2 Analyse von Transkriptom und Proteom 194 12.2.1 Transkriptomanalyse 194 12.2.2 Untersuchungen am Proteom 197 12.2.3 Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen 199 Weiterführende Literatur 201 III Anwendungen der Klonierung und DNA-Analyse in der Biotechnologie 203 13 Die Proteinproduktion mit klonierten Genen 205 13.1 Spezielle Vektoren für die Expression fremder Gene in f. coli 207 13.1.1 Der Promotor ist der entscheidende Bestandteil eines Expressionsvektors 208 13.1.2 Kassetten und Fusionsgene 211 13.2 Allgemeine Probleme mit der gentechnischen Proteinproduktion in E. coli 212 13.2.1 Probleme durch die Sequenz des Fremdgens 212 13.2.2 Probleme durch E. coli 214 13.3 Gentechnische Proteinproduktion mit Eukaryotenzellen 215 13.3.1 Gentechnische Proteinherstellung mit Hefe und Fadenpilzen 215 13.3.2 Gentechnische Proteinproduktion mit Tierzellen 217 13.3.3 Pharming: rekombinante Proteine aus lebenden Tieren und Pflanzen 218 Weiterführende Literatur 220 14 Klonierung und DNA-Analyse in der Medizin 223 14.1 Gentechnische Arzneimittelproduktion 224 14.1.1 Gentechnisch hergestelltes Insulin 224 14.1.2 Synthese menschlicher Wachstumshormone in F. coli 226 14.1.3 Gentechnisch hergestellter Faktor VIII 227 14.1.4 Gentechnische Herstellung anderer menschlicher Proteine 228 14.1.5 Gentechnisch hergestellte Impfstoffe 229 14.2 Identifizierung krankheitserzeugender Gene beim Menschen 232 14.2.1 Die Identifizierung eines krankheitserzeugenden Gens 234 14.3 Gentherapie 236 14.3.1 Gentherapie genetisch bedingter Krankheiten 236 14.3.2 Gentherapie und Krebs 237 14.3.3 Ethische Aspekte der Gentherapie 238 Weiterführende Literatur 239 15 Klonierung und DNA-Analyse in der Landwirtschaft 241 15.1 Das Hinzufügen von Genen bei Pflanzen 242 15.1.1 Pflanzen, die eigene Insektizide produzieren 242 15.12 Herbizidresistente Nutzpflanzen 248 15.1.3 Andere Projekte, bei denen Gene hinzugefügt wurden 250 15.2 Inaktivierung von Genen 250 15.2.1 Antisense-RNA und die gentechnische Veränderung der Reifung von Tomaten 250 15.2.2 Weitere Beispiele für den Einsatz der Antisense-RNA in der Pflanzengentechnik 253 15.3 Probleme mit gentechnisch veränderten Pflanzen 253 15.3.1 Sicherheitsüberlegungen im Zusammenhang mit selektierbaren Markem 254 15.3.2 Das Terminatorverfahren 255 15.3.3 Die Frage nach schädlichen Auswirkungen auf die Umwelt 256 Weiterführende Literatur 257 16 Klonierung und DNA-Analyse in Kriminalistik, Gerichtsmedizin und Archäologie 259 16.1 DNA-Analyse zur Identifizierung Tatverdächtiger 260 16.1.1 Herstellung genetischer Fingerabdrücke durch Hybridisierung 260 16.12 DNA-Typisierung durch PCR kurzer Tandemwiederholungen 261 16.2 Verwandtschaftsnachweis durch DNA-Typisierung 262 16.2.1 Verwandte haben ähnliche DNA-Profile 262 16.2.2 DNA-Typisierung und die sterblichen Überreste der Romanows 263 16.3 Geschlechtsbestimmung durch DNA-Analyse 265 16.3.1 PCR spezifischer Sequenzen aus dem Y-Chromosom 266 16.3.2 PCR des Amelogenin-Gens 266 16.4 Archäogenetik: DNA-Analysen bei der Erforschung der menschlichen Vorgeschichte 267 16.4.1 Die Entstehung der Jetztmenschen 267 16.4.2 Anhand der DNA kann man auch prähistorische Wanderungsbewegungen nachzeichnen 270 Weiterführende Literatur 272 Glossar 275 Stichwortverzeichnis 289