Der Band bietet eine gelungene Mischung aus Lehrbuchtext und Anleitung zum Experiment. Er versammelt alle Modellorganismen (Bakterien, Pilze, Algen, Pflanzen, Tiere) und behandelt die zentralen biologischen Fragen zur Molekulargenetik in folgenden Kapiteln: Einführung in die Biologie der Experimentalorganismen; Kreuzungsexperimente; DNA-Transformationsexperimente; Versuche zur RNA-Analytik, zur Analyse von Nukleinsäure-Protein-Interaktionen, zur PCR-Analytik, zur heterologen Genexpression und zum Einsatz von Reportergenen; Bioinformatik. (Verlagstext)
/ AUS DEM INHALT: / / /
1 Modellorgariismen 1
1.1 Escherichia coli 1
1.1.1 Historisches 3
1.1.2 Lebenszyklus 6
1.1.3 Technische Entwicklungen 8
1.1.4 Biologische Fragestellungen 15
1.1.5 Genetische Ressourcen 15
1.2 Bacillus subtilis 17
1.2.1 . Historisches 18
1.2.2 Lebenszyklus 19
1.2.3 Technische Entwicklungen 20
1.2.4 Biologische Fragestellungen 23
1.2.5 .Genetische Ressourcen 24
1.3 Saccharomyces cerevisiae 25
1.3.1 Historisches 26
1.3.2 Lebenszyklus 28
1.3.3 Technische Entwicklungen 30
1.3.4 Biologische Fragestellungen 41
1.3.5 Genetische Ressourcen 42
1.4 Neurospora crassa und Sordaria macrospom 43
1.4.1 Historisches 44
1.4.2 Lebenszyklus 46
1.4.3 Technische Entwicklungen 49
1.4.4 Biologische Fragestellungen 52
1.4.5 Genetische Ressourcen 53
1.5- Chlamydomonas reinhardtii 55
1.5.1 Historisches 55
1.5.2 Lebenszyklus 57
1.5.3 Technische Entwicklungen 58
1.5.4 Biologische Fragestellungen 64
1.5.5 Genetische Ressourcen 65
1.6 Arabidopsis thaliana 66
1.6.1 Historisches 66
1.6.2 Lebenszyklus 68
1.6.3 Technische Entwicklungen 70
1.6.4 Biologische Fragestellungen .o 72
1.6.5 Genetische Ressourcen 75
1.7 Drosophila melanogaster 75
1.7.1 Historisches 76
1.7.2 Lebenszyklus 78
1.7.3 Technische Entwicklungen 84
1.7.4. Biologische Fragestellungen 86
1.7.5 Genetische Ressourcen 86
2 Genetische Kreuzungen 89
2.1 Escherichia coli 90
2.1.1 Konjugation von E. coli 92
2.2 Saccharomyces cerevisiae 95
2.2.1 Zufallssporenanalyse bei S. cerevisiae 98
2.3 Neurospora crassa und Sordaridmacrospora 102
2.3.1 Einfaktorkreuzung mit Farbspormutanten 105
2.3.2 Kopplungsanalyse mit transgenen Stämmen 108
2.4 Chlamydomorias reinhardtü 111
2.4.1 Tetradenanalyse 113
2.5 Arabidopsis thaliana 116
2.5.1 Kreuzung von Arabidopsis 117
2.5.2 Kartierung mit CAPS-Markern 119
2.6 Drosophila melanogaster 124
2.6.1 Balancer-Chromosomen 127
2.6.2 Fliegenzucht 128
2.6.3 Genetische Kreuzungen mit Drosophila 132
3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen 141
3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis 142
3.1.1 Transformation von E. coli nach der Calciumchlorid-Methode 145
3.1.2 Natürliche Kompetenz von Ä subtilis 148
3.1.3 Transformation von B. subtilis durch Elektroporation 151
3.1.4 Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien 153
3.1.5 Isolation von chromosomaler DNA aus Bacillus subtilis 157
3.2 Saccharomyces cerevisiae 158
3.2.1 Transformation von 5. cerevisiae mit der Gefriermethode 166
3.2.2 Transformation von 5. cerevisiae durch Elektroporation 171
3.2.3 Isolierung von Gesamt-DNA aus S. cerevisiae zum Nachweis einer erfolgreichen Transformation 172
3.3 Sordaria macrospora 176
3.3.1 Transformation von S. macrospora 185
3.3.2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Pilz-Stämmen zum Nachweis einer erfolgreichen Transformation 188
3.4 Chlamydomonas reinhardtii 193
3.4.1 Kerntransformation 198
3.4.2 Chloroplastentransformation 199
3.4.3 Isolierung von Gesamt-DNA 201
3.5 Arabidopsis thaliana 203
3.5.1 Herstellung stabil transformierter Linien 205
3.5.2 Isolierung von genomischer D N A 211
3.5.3 Transiente Transformation steril angezogener Keimlinge 212
3.6 Drosophila melanogaster 215
3.6.1 Nachweis eines markierten P-Elements 216
3.6.2 Genetische Kartierung einer P-Element-Insertion 218
3.6.3 Isolierung genomischer DNA aus Drosophila 219
4 PCR-Analytik 221
4.1 Das Prinzip der PCR 221
4.2 Bedeutung der PCR 224
4.3 Polymerasen für die P C R 224
4.4 PCR-Varianten t 225
4.4.1 NestedVCR, lineare PCR, RAPD-PCR 225
4.4.2 Die RT (reverse Transkription)-PCR 226
4.4.3 Die Real-Time-VCK 226
4.5 Experimentalteil 228
4.5.1 PCR-Analyse von transgenen Pilz-Stämmen 229
4.5.2 PCR zum Integrationsnachweis eines Transgens in Arabidopsis thaliana 235
4.5.3 Inverse P C R zur molekularen Kartierung einer P-Element-Insertion bei Drosophila 236
4.5.4 Nachweis eines Transkriptes mittels RT-PCR 241
5 RNA-Analytik 247
5.1 Transkriptanalysen 247
5.1.1 RNA-Prozessierung bei C. reinhardtii 248
5.1.2 RNA-Isolierung 250
5.1.3 RNA-Gelelektrophorese und Northern Blot 254
5.1.4 Radioaktive Markierung eines Oligonuklssotids und Hybridisierung mit filtergebundener RNA 258
5.2 /"-"Vw-Hybridisierungen an Drosophila-Embryonen 260
6 Analyse von Nukleinsäure-Protein-Interaktionen 265
6.1 /"-ivVo-Analysen 265
6.1.1 Hefe-HYBRID-Analysen 266
6.1.2 Die Wechselwirkung eines Transkriptionsfaktors mit einem Promotorelement 272
6.1.3 ONE-HYBRID-Analysen durch Selektion von Hefe-Transformanten auf Histidin-Prototrophie 273
6.1.4 ONE-HYBRID-Analysen mit Hilfe von LacZ-Tests ausgewählter Hefe-Transformanten 274
6.2 In-vitro-Ana\ysen 276
6.2.1 Nachweis einer Interaktion durch Gelretentionsanalysen 278
6.2.2 Herstellung von Hefe-Proteinextrakt für Bindungsanalysen 280
6.2.3 Herstellung einer radioaktiv markierten Ziel-DNA (bait) 283
6.2.5 Gelretentionsanalyse 286
7 Heterologe Genexpression 291
7.1 Escherichia coli 292
7.1.1 Strategien zur Optimierung der Expression in E. coli 292
7.1.2 Heterologe Synthese eukaryotischer Proteine in E. coli. 300
7.2 Saccharomyces cerevisiae 311
7.2.1 Strategien zur Optimierung der Expression in 5. cerevisiae. 312
7.2.2 Heterologe Genexpression in 5. cerevisiae und Isolierung Virus-ähnlicher Partikel 317
8 Reportergene 323
8.4 Häufig verwendete Reportergene 323
8.1.1 ß-Galactosidase . 3 2 4
8.1.2 ß-Glucuronidase (GUS) 324
8.1.3 Das grün fluoreszierende Protein (GFP) 325
8.2 Expression des egfp-Gtns in Hyphenpilzen 327
8.2.1 Nachweis der GFP-Fluoreszenz i n Sordaria macrospora 328
8.3 Nachweis der ß-Glucuronidase - Aktivität in Arabidopsis thaliana 332
8.3.1 Histochemischer GUS-Test 333
8.3.2 Photometrischer GUS-Test 335
8.4 X-Gal-Färbungen zur Detektion von Enhancer-trap-Insertionen in Drosophila 337
8.4.1 Nachweis der ß-Galactosidase-Expression im Embryo 339
8.4.2 Nachweis der ß-Galactosidase-Expression in Imaginalscheiben 341
8.4.3 Nachweis der ß-Galactosidase-Expression durch eine Antikörperfärbung 342
8.5 Ektopische Expression von Genen in Drosophila melanogaster 344
8.5.1 Experimentalstrategien zur Funktionsanalyse von Drosophila-Genen 344
8.5.2 Überexpression und ektopische Expression eines Transgens 347
9 Bioinformatik 349
9.1 Homologie-Suche in Datenbanken 351
9.1.1 Der BLAST-Algorithmus 353
9.1.2 Die Signifikanz von Alignments 355
9.1.3 Wichtige Parameter für die Datenbanksuche 356
9.1.4 Beispiele zur Datenbanksuche 358
9.2 EST- und Gesamtgenom-Datenbanken 358
9.2.1 ESTs (expressedsequence tags) 358
9.2.2 Beispiele zu ESTs 359
9.2.3 Gesämt-Genom-Sequenzen am Beispiel von Neurospora crassa 360
9.2.4 Beispiele zu Arbeiten mit einer Gesamtgenomdatenbank 361
9.2.5 Beispiele zur Intron-Identifikation mit Hilfe von ESTs und Gesamtgenomdatenbanken 363
9.3 Unbekannte Sequenz - Was tun? 365
9.4 Phylogenie-Analysen 367
9.4.1 Grundlagen der Stammbaum-Analyse 368
9.4.2 Vorgehen bei der Erstellung eines Stammbaumes 370
9.4.3 Beispiele zur Phylogenie-Analyse 371
10 Grundtechniken der molekularen Genetik 375
10.1 Phenolisieren von DNA 375
10.2 Fällungen von Nukleinsäuren 376
10.3 Extraktion von DNA aus Agarosegelen 378
10.3.1 Phenolextraktion aus Agarosegelen 378
10.3.2 Ereeze-and-squeeze-Methode 379
10.4 Restriktionsanalyse und Gelelektrophorese 380
10.5 Southern Blot 382
10.6 Markierung von Nukleinsäuren 383
10.6.1 Oligo-primed-labelling-Techmk 384
10.6.2 5'-Markierung von Oligonukleotiden 385
10.7 DNA-DNA-Hybridisierung 386
Referenzen 389
Literatur 389
Internetadressen 396
Hersteller und Bezugsquellen 396
Stammsammlungen 397
Internetportale, Datenbanken und Programme 397
Glossar 401
Abkürzungen und Symbole 411
Sachverzeichnis 413